Ersetzt Glyphosat Glycin in Proteinen von sich aktiv teilenden Säugerzellen?

Ein Artikel wurde kürzlich von Antoniou et al. mit dem fettgedruckten Titel „Glyphosat ersetzt Glycin nicht in Proteinen, die Säugerzellen aktiv teilen.“ [1] Das Papier bestand darin, menschliche Brustkrebszellen sechs Tage lang Glyphosat auszusetzen und dann eine ausgeklügelte Technik mit der Bezeichnung Tandem Mass Tag (TMT) zu verwenden, um kurze Peptide zu identifizieren, die angeblich anomal schwere Glycinmoleküle enthalten. Die Proteine ​​sowohl der behandelten als auch der unbehandelten Zellen wurden einem Standardprotokoll unterzogen, das Massenspektrometrie, partielle Proteolyse und weitere Analyse umfasste, wie in der Veröffentlichung detailliert beschrieben.

Die Zellen wurden auf einer reichhaltigen Nährformulierung namens Dulbecco’s Modified Eagle Medium gehalten. Diese Formulierung ist eine Modifikation des ursprünglichen Basal Medium Eagle, das vierfach mit Aminosäuren und Vitaminen angereichert ist. Es hat auch eine hohe Konzentration an Glukose bei 4500 mg / l. Es kann nicht garantiert werden, dass es nicht mit Glyphosat kontaminiert ist. Darüber hinaus waren die Zellen in der Vergangenheit einige Zeit in Kultur gezüchtet worden und hatten wahrscheinlich eine erhebliche Anzahl von fehlgefalteten, mit Glyphosat kontaminierten Proteinen angesammelt, die schwer zu klären waren. Sie begannen ihr Leben in der Kultur wahrscheinlich bereits mit Glyphosat-kontaminierten Proteinen durch lebenslange Exposition gegenüber Glyphosat des Menschen, der diese Zellen ursprünglich in einem Brusttumor beherbergte.

Die Autoren testeten die Proben auf zwei verschiedene posttranslationale Modifikationen (PTMs): Glyoxylat-modifiziertes Cystein und Glyphosat-Substitution für Glycin. Sie schlossen die Glyoxylatmodifikation ein, weil sie die Hypothese aufstellten, dass Glyphosat zu Glyoxylat abgebaut werden könnte, das an Cysteinreste binden kann. Insbesondere konnten sie weder in den Kontrollzellen noch in den behandelten Zellen Glyoxylat-modifizierte Cysteine ​​nachweisen.

Im Gegensatz dazu fanden die Autoren in mehreren kurzen Peptiden in den behandelten Proben ein deutliches Signal für das Vorhandensein von Glyphosat. Sie fanden jedoch auch in den unbehandelten Proben ein gleich starkes Signal. Sie schrieben: „In diesem Experiment ist jedoch zu erwarten, dass keine der beiden mutmaßlichen PTMs (posttranslationale Modifikationen) von Interesse vorhanden ist, wenn keine Glyphosatbehandlung durchgeführt wird. Es war daher möglich, TMT-Markierungen zu verwenden, um irgendwelche zu identifizieren und herauszufiltern.“ mögliche falsche Entdeckungen. „Und dann:“ Die Daten zeigen schlüssig, dass alle Kandidaten-substituierten Peptide falsche Entdeckungen sind. „

Ein ebenso plausibles Argument ist jedoch, dass die „unbehandelten“ Zellen auch Glyphosat-substituierte Proteine ​​enthalten. Möglicherweise handelt es sich bei den meisten, wenn nicht allen in Frage kommenden substituierten Peptiden um echte Entdeckungen. Da sowohl die behandelten als auch die Kontrollzellen in der Vergangenheit über einen langen Zeitraum Glyphosat ausgesetzt waren, ist es plausibel, dass sie beide Glyphosat-kontaminierte Proteine ​​in nahezu gleichen Mengen angesammelt hatten. Anthony Samsel und ich diskutierten in unserer ersten Arbeit über die Glyphosatsubstitution von Glycin, dass N-substituierte Glycine Peptoide bilden können, deren Abbau sehr schwierig ist, und dass gezeigt wurde, dass Phosphonate die Fähigkeit besitzen, die Proteolyse zu hemmen [2].

Die Idee, dass Glyphosatexposition zur Akkumulation von Proteolyse-resistenten Proteinen führt, wird durch eine 2013 veröffentlichte Studie an Erbsenpflanzen gestützt [3]. Die Autoren beobachteten eine Anhäufung von ubiquitinierten Proteinen zusammen mit einer Hochregulierung von Proteolyseenzymen, was überraschend und ungewöhnlich ist. Sie schrieben:

“ Die Akkumulation von ubiquitinierten Proteinen zusammen mit einer erhöhten mutmaßlichen Proteasomaktivität wurde durch ABPP [Activity-based Protein Profiling] beobachtet, was eine Rolle für das Proteasom bei der Herbizidbehandlung anzeigt. Die Akkumulation von ubiquitinierten Proteinen wurde typischerweise in Verbindung mit einer gleichzeitigen Abnahme von beschrieben Proteasomaktivität Trotzdem zeigten unsere Ergebnisse sowohl einen Anstieg der Proteasomsubstratkonzentrationen als auch der Proteasomsubstrataktivitäten. Daher kann der durch Herbizide verursachte Stress auf das Proteom trotz der erhöhten Proteasomaktivität zur Akkumulation von ubiquitinierten Proteinen führen oder die Verfügbarkeit des Substrats erhöhen Proteasomaktivität induzieren. “

Eine wahrscheinliche Erklärung ist, dass in die Proteine eingebettetes Glyphosat die Fähigkeit der proteolytischen Enzyme, es abzubauen, stört. In einer Arbeit über die Verknüpfung von Glyphosat mit Amyotropher Lateralsklerose (ALS) haben wir beschrieben, wie Glyphosat den Ubiquitinierungsprozess selbst stören kann, der Proteine für die Deletion durch das Proteasom markiert [4]. Wir schrieben:

„Am faszinierendsten ist die Tatsache, dass Ubiquitin selbst entscheidend von einem hochkonservierten carboxyterminalen Doppelglycinpaar abhängt, um die komplexen Ubiquitinketten aufzubauen, die ein Protein zum Abbau signalisieren [46] [hier als [5] wiedergegeben]. Substitution von entweder durch Glyphosat Von diesen essentiellen Glycinen wird erwartet, dass sie den Prozess des Recyclings von fehlgefalteten Proteinen beeinträchtigen. Dies könnte leicht die Akkumulation von fehlgefalteten Proteinen erklären, die ein charakteristisches Merkmal von ALS ist. “

Zum Glück haben Antoniou et al. [1] in ihrer Tabelle 3 die genauen Sequenzen mit nachgewiesenen Glyphosat-Substitutionen und auf der Uniprot-Website ein Tool, mit dem man mithilfe eines Softwarepakets namens BLAST Proteine ​​finden kann, die spezifische Sequenzen enthalten. Uniprot war in der Lage, die Identität aller 15 in Abbildung 3 als Treffer angegebenen Proteine ​​abzurufen, wobei eine genaue Übereinstimmung mit einer in jedem Protein vorhandenen Sequenz erzielt wurde. Alle 15 Proteine ​​waren menschliche Proteine. Mindestens neun dieser Proteine ​​binden an phosphathaltige Moleküle, wie in Tabelle 1 aufgeführt. Dies unterstützt die Idee, dass Proteine, die Phosphat binden, besonders anfällig für Glyphosatsubstitution sind, wie in einem kürzlich veröffentlichten Aufsatz von Gunatilake et al. [6], der vorschlägt, dass Glyphosat ein Hauptfaktor bei chronischen Nierenerkrankungen mit unbekannter Ätiologie (CKDu) bei Landarbeitern in Sri Lanka ist. Tatsächlich enthält die Protein-EPSP-Synthase in Pflanzen, von der angenommen wird, dass sie das Hauptziel von Glyphosat bei der Abtötung von Unkräutern ist, einen hochkonservierten Glycinrest an der Stelle, an der Phosphoenolpyruvat (PEP) bindet. Dank eines CRISPR-modifizierten Gens für die EPSP-Synthase konnten Forscher von DowDupont mithilfe der CRISPR-Technologie einen gegen Glyphosat resistenten Maisstamm erzeugen [7]. Der erste Schritt bestand darin, den DNA-Code zu ändern, um das Glycin an der PEP-Bindungsstelle durch Alanin zu ersetzen. Dies führte zu einer Version des Enzyms, die gegenüber Glyphosat vollständig unempfindlich war.

Tabelle 1: Neun Proteine, die Glyphosat-substituierte Peptide enthalten, wie unter Verwendung von Tandem Mass Tag (TMT) -Spektrometriewerkzeugen identifiziert. Diese Peptide wurden zusammen mit weiteren 6 in in Kultur gezüchteten Krebszellen gefunden. Alle neun binden an phosphathaltige Moleküle, wie in der dritten Spalte angegeben. Die erste Spalte enthält die nachgewiesene Sequenz, wobei das „*“ einen Glycinrest angibt, der als substituiert befunden wurde. Siehe: Antoniou et al. (2019) für Details zum Versuchsaufbau.

Insgesamt zeigt Tabelle 1 eine faszinierende Liste menschlicher Proteine, von denen erwartet werden kann, dass viele in Brustkrebszellen exprimiert werden. Zum Beispiel ist eines ein RNA-Methylierungsprotein (tRNA (Guanin (10) -N 2) -Methyltransferase-Homolog). Ein anderer hat eine Tumorsuppressorfunktion durch Akt-Hemmung, indem er an Phosphatidylinositolphosphate bindet (Pleckstrin-Homologiedomäne enthaltendes Mitglied der Familie A 5). Ein anderer ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR). Nach Bar-Shavit et al. „Kontrollieren GPCRs viele Merkmale der Tumorentstehung, einschließlich Immunzell-vermittelter Funktionen, Proliferation, Invasion und Überleben am sekundären Ort.“ [8] Ein weiterer Treffer ist ein Homöobox-Protein, von dem angenommen wird, dass diese Proteinklasse eine kausale Rolle bei Brustkrebs spielt [9].

Eine weitere wichtige Entdeckung aus dieser Veröffentlichung sind die beiden Proteine, die als Reaktion auf die sechstägige Glyphosatbehandlung als statistisch signifikant hochreguliert identifiziert wurden. Dies sind: ADP / ATP-Nucleotid-Translokase (ANT) und Serin / Arginin-reicher Spleißfaktor 6 (SRSF6) [1]. Diese beiden Proteine ​​erweisen sich als sehr interessant, da bekanntermaßen beide in Tumorzellen überexprimiert werden und in beiden Fällen höhere Spiegel dieser Proteine ​​mit einem schlechten Ergebnis bei Krebspatienten zusammenhängen.

SRSF6 gehört zur Familie der Spleißfaktoren, die die Proteinexpression stark verändern können, indem sie modifizieren, wie Peptide aus einzelnen Exons zusammengesetzt werden. Überexpression von SRSF6 in Lungenepithelzellen verstärkte die Proliferation, schützte sie vor Chemotherapie und erhöhte ihre Fähigkeit, Tumore zu bilden [10]. Darüber hinaus reduzierte der Abbau von SRSF6 in Lungen- und Dickdarmkrebszelllinien deren tumorigenes Potenzial. SRSF6 wird häufig bei Hautkrebs exprimiert und verändert das Spleißen eines Proteins namens Tenascin C, um invasiven und metastasierenden Krebs zu fördern [11]. SRSF6 verursacht auch eine übermäßige Vermehrung von Keratinozyten, ein charakteristisches Merkmal der Psoriasis [12]. Wenn Glyphosat bewirkt, dass SRSF6 in Brustkrebszellen hochreguliert wird, verursacht es wahrscheinlich eine verstärkte Tumorentstehung bei exponierten Menschen.

ANT kommt in mehreren verschiedenen Isoformen mit unterschiedlichen Auswirkungen auf die Zellbiologie vor, aber die in Brustkrebszellen stark exprimierte ist ANT2, und es hat sich als wichtig für die Aufrechterhaltung des Tumorüberlebens erwiesen. ANT2 hat die Aufgabe, ATP in die Mitochondrien zu transportieren. Diese Aktivität ist wichtig, wenn eine Zelle unter den Voraussetzungen des Warburg-Effekts arbeitet. Krebszellen produzieren viel ATP im Zytoplasma durch Glykolyse, und dann transportiert ANT2 das ATP in die Mitochondrien, so dass sie die ATP-Menge reduzieren können, die sie durch oxidative Phosphorylierung produzieren müssen. Dies ist eine gute Strategie zum Schutz vor oxidativen Schäden, insbesondere dann, wenn Mitochondrien aufgrund von DNA-Mutationen, die durch toxische Expositionen verursacht werden, möglicherweise gestört sind. Tatsächlich programmiert ANT2 eine Zelle, um Strategien zu implementieren, die bei Vorhandensein von Stressoren zu einer erhöhten Proliferation und nicht zu Apoptose (Zelltod) führen [13]. In jüngster Zeit bestand Interesse an der Entwicklung von Arzneimitteln zur Bekämpfung von Krebs durch Unterdrückung der ANT2-Aktivität [14].

Das Patent von Antoniou et al. Papier könnte ein bedeutender Durchbruch bei unserer Suche nach einem Verfahren zum Nachweis der Glyphosat-Kontamination in Proteinen sein. Es ist bemerkenswert, dass sie 15 menschliche Proteine ​​identifizieren konnten, die anscheinend durch Glyphosatsubstitution für einen bestimmten Glycinrest modifiziert wurden. Das Papier ist für die Allgemeinheit von großem Wert, da es ein vorgeschriebenes Verfahren festlegt, das nun eher routinemäßig auf mehrere andere in Kultur gezüchtete Zelltypen sowie auf biologische Proben angewendet werden kann, die aus erkrankten Geweben bei Säugetieren wie Fingernägeln extrahiert wurden von Sklerodermiepatienten, Hautzellen bei Psoriasispatienten, Haarproben von autistischen Kindern, Hufen von Pferden, die an einem Gründerleiden leiden, Tumorbiopsien, Alzheimer-Plaque-Postmortem, erkrankten Nieren- und Lebergeweben usw.

Zukünftige Möglichkeiten zur Entdeckung von Glyphosat-kontaminierten Proteinen gibt es zuhauf. Wenn wir eine Datenbank mit spezifischen Substitutionsmustern zusammenstellen, können wir möglicherweise sogar Regeln für Peptidkontexte vorhersagen, in denen Glycinreste besonders anfällig sind, z. B. wenn benachbarte Aminosäuren klein sind (um dies zu verhindern) sterische Hinderung) oder positiv geladen (um Glyphosat aufgrund seiner negativen Ladung an die Stelle des Peptidaufbaus zu ziehen). Tatsächlich werden diese Arten von Regeln bereits in der kleinen Menge deutlich, die in dem Artikel von Antoniou et al. Experiment. Sechs der 15 angeblich substituierten Glycine folgten unmittelbar eine positiv geladene Aminosäure (Lysin, Histidin oder Arginin). Zehn von ihnen gingen Valin, Leucin, Serin oder Threonin voraus, allesamt kleine Aminosäuren, die Platz für den Glyphosat-Methylphosphonyl-Schwanz bieten. Wenn Glyphosat tatsächlich Glycin während der Proteinsynthese ersetzt, sind die Folgen verblüffend und die heimtückischen kumulativen toxischen Wirkungen von Glyphosat können leicht den Anstieg erklären, den wir heute bei der Prävalenz einer langen Liste von Autoimmun-, Stoffwechsel-, neurologischen und onkologischen Erkrankungen beobachten.

Verweise

[1] MN Antoniou et al. Glyphosat ersetzt Glycin nicht in Proteinen, die Säugerzellen aktiv teilen. BMC Res Notes 2019; 12: 494. (Weblink)
[2] Ein Samsel und S Seneff. Glyphosat, Wege zu modernen Krankheiten V: Aminosäureanalogon von Glycin in verschiedenen Proteinen. Zeitschrift für Biologische Physik und Chemie 2016; 16: 9-46. (Weblink) (Download)
[3] Ein Zulet et al. Proteolytische Wege, die durch Herbizide induziert werden, die die Aminosäurebiosynthese hemmen. PLoS ONE 2013; 8 (9): e73847. (Weblink)
[4] S. Seneff et al. Trägt Glyphosat als Glycinanalogon zur ALS bei? J Bioinfo Proteomics Rev. 2016: 2 (3): 1-21. (Weblink) (Download)
[5] Ein Artikel von Zuin et al. Ubiquitin-Signal: Extreme Erhaltung als Quelle der Vielfalt. Cells 2014; 3 (3): 690-701. (Weblink)
[6] S. Gunatilake et al. Die synergistische Toxizität von Glyphosat in Kombination mit anderen Faktoren als Ursache einer chronischen Nierenerkrankung unbekannten Ursprungs. Int J Environ Res Public Health 2019; 16 (15). pii: E2734. (Weblink) (Download)
[7] Y Dong et al. Desensibilisierung der pflanzlichen EPSP-Synthase zu Glyphosat: Der optimierte globale Sequenzkontext berücksichtigt eine Glycin-Alanin-Änderung im aktiven Zentrum. J Biol Chem 2019; 294 (2): 716 & ndash; 725. (Weblink)
[8] R. Bar-Shavit et al. G Protein-gekoppelte Rezeptoren bei Krebs. Int J Mol Sci 2016; 17 (8). pii: E1320. (Weblink)
[9] MT Lewis. Homöobox-Gene bei der Entwicklung von Brustdrüsen und Neoplasien. Brustkrebsforschung 2000; 2: 159. (Weblink)
[10] M. Cohen-Eliav et al. Der Spleißfaktor SRSF6 wird verstärkt und ist ein Onkoprotein bei Lungen- und Dickdarmkrebs. J Pathol 2013; 229 (4): 630 & ndash; 9. (Weblink)
[11] MA Jensen et al. Der Spleißfaktor SRSF6 fördert die Hyperplasie sensibilisierter Haut. Nat Struct Mol Biol 2014; 21 (2): 189197. (Weblink)
[12] H. Valdimarsson et al. Psoriasis: eine Krankheit mit abnormaler Keratinozyten-Proliferation, die durch T-Lymphozyten induziert wird. Immunol Today 1986; 7 (9): 256-9. (Weblink)
[13] SH Baik und J Lee. Adeninnukleotid-Translokase 2: ein aufstrebender Akteur bei Krebs. J Stem Cell Res Med 2016; 1 (2): 66 & ndash; 68. (Weblink)
[14] J-Y Jang et al. Die Unterdrückung der Adeninnukleotid-Translokase-2 durch vektorbasierte siRNA in menschlichen Brustkrebszellen induziert Apoptose und hemmt das Tumorwachstum in vitro und in vivo. Brustkrebsforschung 2008; 10 (1): R11. (Weblink)